BadaniaOjcostwa.pl

VNTR (z ang. variable number tandem repeats, zmienna liczba tandemowych powtórzeń). Miejsce w genomie zawierające powtarzający się motyw nukleotydów, np. ACTACTACTACTACT… Sekwencję VNTR można zapisać w schematyczny sposób, np. (ACT)n, gdzie ‘n’ oznacza liczbę powtórzeń określonego motywu. W powtórzeniach tandemowych motyw ułożony jest w tym samym kierunku we wszystkich powtórzeniach (por. inverted repeats). Loci VNTR na ogół charakteryzują się wysokim poziomem zmienności w populacji. Loci VNTR można podzielić ze względu na długość motywu na: mikrosatelity o długości motywu od 1 do 5 par zasad, minisatelity o długości motywu od 6 do ok. 100 par zasad. Do sekwencji powtarzalnych należy również DNA satelitarne.

W genetyce, biologii molekularnej oraz inżynierii genetycznej technika polegająca na znajdowaniu liczby powtórzeń motywu w locus. Po raz pierwszy metoda VNTR została zastosowana w procesie tworzenia genetycznej mapy człowieka. Technika VNTR opiera się na analizie tandemowo powtarzających się sekwencjach par zasad o długości kilkunastu do kilkudziesięciu nukleotydów zwanych minisatelitarnym DNA. Liczba powtórzeń sekwencji minisatelitarnych może wynosić nawet do 1000 powtórzeń i jest często zróżnicowana wśród genotypów tego samego gatunku biologicznego co jest powodowane licznymi zdarzeniami rekombinacyjnymi.

RFLP (ang. Restriction Fragments Length Polymorphism – polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych).

RFLP jest wykorzystywany w technice, w której organizmy mogą być różnicowane poprzez analizę wzorów pochodzących z pocięcia ich DNA.

Tą techniką wykrywa się różnice pomiędzy rozmiarami fragmentów DNA pociętych restryktazami. Różnice długości fragmentów DNA powstają w wyniku mutacji, które tworzą lub eliminują miejsca rozpoznawane przez te enzymy. Sekwencje polimorficzne RFLP, które wykrywa się tą metodą, są używane jako znaczniki zarówno w mapach fizycznych jak i genetycznych.

Jest to metoda, która pozwala na wykazanie powiązań rodzinnych poprzez porównywanie charakterystycznych wzorów polimorficznych, które są otrzymywane, gdy określone regiony łańcucha DNA są powielane (szczególnie przy użyciu techniki PCR) i pocięte przez określone enzymy restrykcyjne.

RFLP jest kluczowym narzędziem w rozpoznawaniu DNA, określaniu obecności różnych alleli u osobników. Mapowanie polimorficznych długości fragmentów restrykcyjnych jest także używane w hodowli roślin po to, by wykazać czy cecha taka jak np. odporność na choroby, została odziedziczona. Podobnie jeżeli polimorfizm zostaje wykryty w pobliżu miejsca gdzie występuje defekt genetyczny, RFLP jest wartościowym znacznikiem pokazującym drogę dziedziczenia tego defektu. W szczególności dana osoba może być zidentyfikowana dzięki tej metodzie przy badaniu pozostałości krwi, włosów i nasienia i w związku z tym RFLP jest szeroko używana w kryminalistyce. Z wyjątkiem bliźniąt jednojajowych^[1][2][3] metoda ta pozwala na niemalże pewne odróżnianie poszczególnych osób. Jednak nawet w przypadku identycznych bliźniąt pojawiły się doniesienia o możliwości stosowania tej analizy DNA do ich rozróżnienia^[4].

Pierwszym przestępcą skazanym na podstawie takiego materiału dowodowego był w 1987 brytyjski piekarz Colin Pitchfork, skazany za dwa morderstwa połączone z gwałtem; w 1989 doszło do pierwszego uniewinnienia w oparciu o badanie RFLP – pierwotnie skazany na podstawie relacji świadków na 50 lat więzienia za gwałt i porwanie, Amerykanin Gary Dotson został uniewinniony po przeprowadzeniu badań DNA w kilka lat po rozpoczęciu odbywania wyroku. Gdy stosowanie tej techniki dochodzeniowej zostało nagłośnione, pojawiły się też pierwsze przypadki oszustw: w 1992 kanadyjski doktor John Schneeberger, oskarżony o gwałt na pacjentce, wszczepił we własne ramię zasobnik z obcą krwią i antykoagulantami, by uniknąć pobrania obciążającej go próbki na potrzeby badań. Porównanie fragmentów restrykcyjnych matki, dziecka i domniemanego ojca pozwala także na potwierdzenie lub wykluczenie ojcostwa.

Sekwencjonowanie DNA – technika odczytywania sekwencji, czyli kolejności par nukleotydowych w cząsteczce DNA.

Sekwencjonowanie dokonuje się obecnie głównie za pomocą zautomatyzowanych sekwencjonatorów. Manualne sekwencjonowanie stosuje się przy opracowywaniu nowatorskich metod, w niektórych laboratoriach dla krótkich fragmentów lub podczas ćwiczeń^{[potrzebne źródło]}.

• Przykład sekwencji DNA (początek operonu laktozowego E. coli z GenBank):

GACACCATCGAATGGCGCAAAACCTTTCGCGGTATGGCATGATAGCGCCCGGAAGAGAGTCAATTCAGGG

gdzie: A – deoksyadenozyna; C – deoksycytydyna; G – deoksyguanozyna; T – tymidyna

Sekwencjonowania DNA metodą Sangera z użyciem znakowanych dideoksynukleotydów
A – przykładowa sekwencja DNA
B – przyłączenie startowego oligonukleotydu do nici matrycowej i kierunek syntezy DNA
C – produkty syntezy DNA, zakończone fluorescencyjnieznakowanymi dideoksynukleotydami (kolorowe litery)
D – elektroforegram rozdziału otrzymanej mieszaniny fragmentów w elektroforezie kapilarnej wraz z zidentyfikowaną sekwencją (powyżej)

Metody Historyczne

Historyczną już i wypieraną metodą jest opracowana w 1977 r. metoda Sangera, oparta o syntezę DNA przez polimerazę DNA in vitro^[1]. Do reakcji dodaje się niewielką ilość trifosforanów dideoksynukleotydów (ddNTP), które są wbudowywane w DNA, ale ich dołączenie uniemożliwia dalsze wydłużanie nici. W ten sposób otrzymuje się fragmenty DNA o różnej długości zakończone specyficznym nukleotydem. Produkty reakcji rozdziela się elektroforetycznie, co powoduję ich segregację pod względem wielkości.

Autorem alternatywnej metody sekwencjonowania DNA, z wykorzystaniem specyficznej, chemicznej degradacji DNA, byli Walter Gilbert i Allan Maxam (metoda Maxama-Gilberta)^[2]. Gilbert wraz zFrederickiem Sangerem otrzymali za to osiągnięcie nagrodę Nobla w dziedzinie chemii. Metoda Maxama-Gilberta obecnie jest rzadko stosowana.

Metody współczesne

Obecnie odczyt sekwencji w metodzie Sangera został zautomatyzowany dzięki wykorzystaniu znakowanych fluorescencyjnie trifosforanów dideoksynukleotydów i pozwala na odczyt 300-1000 par zasad z jednej kapilary lub linii na żelu^{[potrzebne źródło]}.

Nowoczesne masowo równoległe aparaty do sekwencjonowania DNA są w stanie pracować z szybkością rzędu milionów par zasad na godzinę^{[potrzebne źródło]}. Tranzystory polowe DNAumożliwiają użycie natywnego DNA w hybrydyzacji do mikromacierzy i odczyt w czasie rzeczywistym.

Nagroda Archon Genomics X PRIZE w wysokości 10 mln dolarów czeka na ośrodek, który będzie w stanie zsekwencjonować 100 genomów ludzkich w ciągu 10 dni^[3]. Pierwsze sekwencjonowanie genomu człowieka zajęło wiele lat (zob. Projekt poznania ludzkiego genomu).

Nowoczesne metody sekwencjonowania DNA są na tyle tanie, iż setki tysięcy osób zapłaciły za zbadanie swojego DNA i wzięły udział w Projekcie Genograficznym. Ta względna taniość umożliwiła również rozwój m.in. genetyki genealogicznej oraz wielu rodzajów badań testujących obecność mutacji.

Metody rozwojowe

• pirosekwencjonowanie; jego wersja „sekwencjonowanie 454″ pozwala odczytać 300 MBp na dzień w jednej maszynie. Metoda ta jest szczególnie przydatna do sekwencjonowania aDNA.
• bezpośredniego odczytu^{[potrzebne źródło]}:
  • nanosekwencjonowanie. Przesuwająca się cząsteczka DNA poprzez centrum aktywne modyfikowanych polimeraz jest odczytywana bezpośrednio. Szybkość takiego odczytu może dochodzić od 300 Bp/s dla pojedynczego nanometrowego czujnika^[4].
  • mikroskopowe

Historia rozwoju metod sekwencjonowania DNA

• 1953 – opracowanie modelu podwójnej helisy DNA przez Jamesa Watsona i Francisa Cricka
• 1972 – opracowanie sposobów izolacji materiału do dalszych badań. Rozwój technologii rekombinacji umożliwiający izolację dowolnych fragmentów DNA i ich replikację.
• 1977 – Allan Maxam i Walter Gilbert ogłaszają publikację pt. Sekwencjonowanie DNA przez chemiczną degradację. W tym samym czasie Sanger opublikował też metodę sekwencjonowania DNA przez syntezę katalizowaną enzymatycznie.
• 1980 – Fred Sanger i Walter Gilbert otrzymali nagrodę Nobla
• 1982 – utworzono Genbank – publicznie dostępną bazę danych sekwencji DNA
  • Andre Marion i Samuel Eletr utworzyli firmę Applied Biosystems, która w tym okresie zdominowała automatyczne sekwencjonowanie DNA
• 1982 – Akiyoshi Wada zbudował roboty sekwencyjne dla firmy Hitachi.
• 1984 – badacze z MRC odczytali kompletną sekwencję wirusa Epstein-Barr, 170 kb.
• 1997 – zsekwencjonowano 5Mb genom bakterii Escherichia coli.
• 2001, 15 lutego – Konsorcjum HUGO opublikowało sekwencję genomu ludzkiego w Nature.
• 2001, 16 lutego – firma Celera Genomics opublikowała sekwencję genomu ludzkiego w Science.